Thesis:

Desarrollo de proteínas nanoestructuradas como plataforma inmunoestimulante frente a Piscirickettsia salmonis en salmón del Atlántico

En Chile la producción intensiva de salmón del Atlántico impacta negativamente el sistema inmune de los peces y aumenta la vulnerabilidad a infecciones como la Piscirickettsiosis. Esta enfermedad bacteriana alcanza mortalidades cercanas al 50 % y genera pérdidas de aproximadamente USD 700 millones anuales. Pese a invertir más de USD 200 millones en antibióticos y vacunas, el 90 % de las 400 t de antimicrobianos utilizados en la acuicultura chilena, se destinan a esta enfermedad sin lograr un control efectivo, lo que evidencia la necesidad de alternativas más sostenibles. En este contexto, los péptidos antimicrobianos (AMPs) surgen como candidatos prometedores debido a su acción directa sobre patógenos y su capacidad inmunomoduladora, aunque su uso práctico ha sido limitado por problemas de estabilidad y susceptibilidad a degradación. El objetivo de esta tesis fue desarrollar cuerpos de inclusión (IBs) basados en AMPs como plataforma inmunoestimulante frente a la Piscirickettsia salmonis en salmón del Atlántico. La metodología contempló la producción de estos IBs empleando la cepa E. coli BL21 pLysS, los cuales se purificaron mediante lavados con soluciones enzimáticas y tampones de lisis, se cuantificaron mediante Western blot, y se caracterizaron mediante microscopía electrónica de barrido de emisión de campo (FESEM). Se llevaron a cabo análisis de toxicidad e internalización en células RTS-11, para luego evaluar el potencial de los IBs para estimular el sistema inmune, mediante ensayos de expresión de genes asociados a la respuesta inflamatoria (il-8, il-10, il-1β, tnf-α, iNOS) tanto en células (dosis 5-20 µg/mL) como en peces (dosis 5 mg/kg). Así mismo se llevaron a cabo ensayos de infección in vitro con P. salmonis, y pruebas de actividad antimicrobiana frente a P. salmonis. De forma complementaria se comparó la producción de IBs de la citocina modelo IL-1β en matraz y biorreactor para evaluar escalabilidad. Los AMPs se produjeron exitosamente en forma de IBs, representaron aproximadamente el 70 % del total de proteínas a las 5 h de producción, y el rendimiento superó los 30 mg/L, a las 3 h. Asimismo, los IBs demostraron ser estables frente a condiciones térmicas y de pH gastrointestinal simulado. El modelo complementario de escalamiento en biorreactor fue satisfactorio, obteniendo aproximadamente el doble de rendimiento respecto al matraz. Los IBs demostraron citoxicidad menor al 10 % en el modelo celular, y modularon la expresión de citocinas pro y antiinflamatorias (il-8, il-10 e il-1β), sugiriendo un perfil regulador a las 12 h postratamiento. Durante los ensayos in vivo, se incrementó la expresión del gen il-1β a las 6 y 12 h para catelicidina y hepcidina respectivamente. En células infectadas no hubo modulación significativa de la respuesta génica, no obstante, la exposición directa de P. salmonis a los IBs redujo su supervivencia en al menos un 50 %, hasta los 12 días. Finalmente, los ensayos in vitro sugieren(...).