Thesis:

Development of a production strategy based on the modification of metabolic regulation processes in Komagataella phaffii

Komagataella phaffii is one of the most widely used yeast cell factories for recombinant protein (rProt) production in the industry. Its success has been largely attributed to the strong alcohol oxidase 1 promoter (pAOX1), which is traditionally induced by methanol. However, the toxicity and handling constraints of methanol limit its industrial applicability. Recently, a formate dehydrogenase (FDH)-deficient strain of K. phaffii has been reported, demonstrating that formate is a key metabolite for pAOX1 induction in sorbitol media. This doctoral research has been focused on developing methanol-free induction strategies for pAOX1 in this FDH-deficient strain to improve rProt production. The results showed that sorbitol dehydrogenase (SOR1) gene overexpression, based on the limitation imposed by slow sorbitol uptake, enhanced sorbitol metabolism and growth rate. However, it also decreased intracellular formate accumulation, a key metabolite involved in pAOX1 induction in this strain. Consequently, this effect reduced pAOX1 induction and the synthesis of model rProts, such as enhanced green fluorescent protein (eGFP) and Candida antarctica lipase (CalB). Oxygen transfer conditions (OTC) were also found to play a critical role in pAOX1 regulation, formate accumulation, and increased eGFP production. Furthermore, engineering of the L-serine biosynthesis pathway through overexpression of the 3-phosphoglycerate dehydrogenase (SER3) gene, based on previous results obtained in serine-sorbitol media, enhanced intracellular formate levels and improved the balance between growth and rProt production. SER3 strains exhibited up to 48% higher specific eGFP fluorescence and 30% higher glucose oxidase (Gox) activity compared to the parental strain. These findings highlight(...).

Komagataella phaffii est l’une des plateformes cellulaires de levure les plus largement utilisées dans l’industrie pour la production de protéines recombinantes (rProt). Son succès est principalement attribué au puissant promoteur de l’alcool oxydase 1 (pAOX1), traditionnellement induit par le méthanol. Cependant, la toxicité et les contraintes de manipulation du méthanol limitent son applicabilité industrielle. Récemment, une souche déficiente en formiate déshydrogénase (FDH) de K. phaffii a été décrite, utilisant le formiate comme métabolite clé pour l’induction de pAOX1 en milieu sorbitol. Cette recherche doctorale s’est concentrée sur le développement de stratégies d’induction sans méthanol pour pAOX1 dans cette souche déficiente en FDH, afin d’améliorer la production de rProt. Ces résultats ont montré que la surexpression du gène de la sorbitol déshydrogénase (SOR1), basée sur la limitation de l’absorption lente du sorbitol, a amélioré le métabolisme du sorbitol et le taux de croissance. Cependant, l'accumulation intracellulaire de formiate, un métabolite clé impliqué dans l'induction de pAOX1 chez cette souche, a diminué. Par conséquent, cet effet a diminué l’induction de pAOX1 et la synthèse de protéines recombinantes modèles, telles que la protéine fluorescente verte améliorée (eGFP) et la lipase de Candida antarctica (CalB). Les conditions de transfert d’oxygène (OTC) ont également joué un rôle critique dans la régulation de pAOX1, l’accumulation de formiate et l’augmentation de la production d’eGFP. En outre, l’ingénierie de la voie de biosynthèse de la L-sérine via la surexpression du gène de la 3-phosphoglycérate déshydrogénase (SER3), basée sur des résultats précédents obtenus en milieu sérine-sorbitol, a augmenté les niveaux intracellulaires de formiate et amélioré l’équilibre entre croissance et production de rProt. Les souches SER3 ont présenté jusqu’à 48 % de fluorescence spécifique d’eGFP en plus et 30 % d’activité supplémentaire de glucose oxydase (Gox) par rapport à la souche parentale. Ces résultats mettent en évidence(...).

Komagataella phaffii es una de las fábricas celulares de levadura más utilizadas en la industria para la producción de proteínas recombinantes (rProt). Su éxito se ha atribuido en gran medida al fuerte promotor alcohol oxidasa 1 (pAOX1), que tradicionalmente se induce con metanol. Sin embargo, la toxicidad y las limitaciones de manejo del metanol restringen su aplicabilidad industrial. Recientemente, se ha descrito una cepa deficiente en formiato deshidrogenasa (FDH) de K. phaffii que utiliza el formiato como metabolito clave para la inducción de pAOX1 en medios con sorbitol. Esta investigación doctoral se ha centrado en el desarrollo de estrategias de inducción libres de metanol para pAOX1 en esta cepa deficiente en FDH, con el objetivo de mejorar la producción de rProt. Estos resultados mostraron que la sobreexpresión del gen de sorbitol deshidrogenasa (SOR1), basada en la limitación de la captación lenta de sorbitol, aumentó el metabolismo del sorbitol y la tasa de crecimiento. Sin embargo, disminuyó la acumulación intracelular de formiato, que es un metabolito clave relacionado con la inducción de pAOX1 en esta cepa. En consecuencia, este efecto redujo la inducción de pAOX1 y la síntesis de proteínas recombinantes modelo, como la proteína fluorescente verde mejorada (eGFP) y la lipasa de Candida antarctica (CalB). También se observó que las condiciones de transferencia de oxígeno (OTC) desempeñan un papel crítico en la regulación de pAOX1, la acumulación de formiato y el aumento de la producción de eGFP. Por otra parte, la ingeniería de la vía de biosíntesis de L-serina mediante la sobreexpresión del gen de la 3-fosfoglicerato deshidrogenasa (SER3), basada en resultados previos obtenidos en medios serina-sorbitol, aumentó los niveles intracelulares de formiato y mejoró el equilibrio entre crecimiento y producción de rProt. Las cepas SER3 mostraron hasta un 48% más de fluorescencia específica de eGFP y un 30% más de actividad de glucosa oxidasa (Gox) en comparación con la cepa parental. Estos hallazgos ponen de relevancia(...).