Thesis:

Producción y caracterización de cuerpos de inclusión recombinantes para ser usados como antígenos en un prototipo de vacuna contra Piscirikettsia salmonis

Piscirickettsia salmonis is the etiological agent of Piscirickettsiosis, one of the most severe and detrimental diseases affecting the Chilean salmon farming industry. Currently, there are 26 vaccines with provisional registration available for prophylactic use in salmonids. However, none have proven effective in fully controlling epidemic outbreaks under field conditions. Several researchers have identified two predominant genogroups along the Chilean coast, designated as LF-89 and EM-90, which exhibit a variable spatiotemporal distribution in southern Chilean salmon farms in recent years. Recent evidence suggests that the biological mechanisms of both genogroups may interact synergistically during infection, indicating the potential for co-infections in contemporary farms. This scenario further complicates vaccine efficacy, as many are designed to target only a predominant genogroup. Thus, the need arises to identify alternative prophylactic methods to ensure and contribute to the sustainability of the Chilean salmon farming industry. A novel prophylactic approach proposed in this thesis involves the use of recombinant nanoproteins, also known as inclusion bodies, with antigenic functions against Piscirickettsiosis. These inclusion bodies are aggregates of soluble and insoluble proteins with amyloid characteristics, eliminating the need for encapsulation. They are scalable, lyophilizable, and highly stable under adverse temperature and pH conditions. This thesis aims to evaluate the ability of certain antigenic protein inclusion bodies from P. salmonis to induce an adaptive immune response in Atlantic salmon (Salmo salar) and their potential use as immunogens in a vaccine prototype. To achieve this objective, three antigenic sequences with chimeric characteristics from the LF-89 and EM-90 genogroups of P. salmonis were designed and produced as recombinant inclusion bodies in E. coli BL21(DE3). The prototypes were designated for commercial protection purposes as SkipZ, PulseJ, and HopQ. These prototypes were quantified and characterized using techniques such as Western blot. Their uptake and immunostimulatory activity were evaluated in salmon macrophages through in vitro assays. Subsequently, juvenile salmon were vaccinated, and the effects of the SkipZ and HopQ prototypes were analyzed in terms of gene expression (qPCR) and immunoglobulin production (ELISA). The three prototypes achieved production efficiencies of 57 mg/L for PulseJ, 40 mg/L for SkipZ, and 26,8 mg/L for HopQ. These prototypes were internalized by salmon macrophages (RTS-11) with uptake efficiencies of 5% for SkipZ, 26% for PulseJ, and 54% for HopQ. In vitro assays showed activation at both transcriptional and translational levels of molecules associated with antigen presentation and pro-inflammatory markers, with notable activation capacities observed for HopQ and SkipZ at 20 µg/mL and 5 µg/mL, respectively. In vivo assays revealed that both vaccine prototypes, administered at doses of 0.5 mg/kg of fish for SkipZ and 2 mg/kg of fish for HopQ, robustly activated the Th1 response, with a marked increase in IFN-γ and IL-12 expression. This strong upregulation might suppress CD8+ lymphocyte differentiation, potentially reducing the effectiveness of the cellular immune response in fully eliminating the pathogen. However, this effect may contribute to maintaining homeostasis in fish during the exacerbated inflammation induced by the vaccines. Moreover, no significant change was observed in the Th2 response, suggesting that the humoral response was not predominantly activated. In conclusion, the vaccine prototypes based on antigenic sequences of Piscirickettsia salmonis and produced as chimeric inclusion bodies demonstrated potent immunogenicity, capable of inducing a robust adaptive immune response in Atlantic salmon. The activation of the Th1 response by HopQ and SkipZ was particularly noteworthy. However, further studies are needed to evaluate their protective effects in challenge trials with the pathogen, including both genogroups, and to determine their long-term effectiveness.

Piscirickettsia salmonis es el agente etiológico de la piscirickettsiosis, una de las enfermedades más graves y perjudiciales que afectan a la salmonicultura chilena. Actualmente, existen 26 vacunas con registro provisional disponibles para uso profiláctico en salmónidos. Sin embargo, ninguna ha demostrado ser eficaz para controlar completamente los brotes epidémicos en condiciones de campo. Varios investigadores han identificado dos genogrupos predominantes a lo largo de la costa chilena, denominados LF-89 y EM-90, que presentan una distribución espaciotemporal variable en las granjas salmoneras del sur de Chile en los últimos años. Evidencias recientes sugieren que los mecanismos biológicos de ambos genogrupos podrían interactuar sinérgicamente durante la infección, lo que indica la posibilidad de coinfecciones en las granjas actuales. Este escenario complica aún más la eficacia de las vacunas, ya que muchas están diseñadas para actuar únicamente sobre un genogrupo predominante. Por lo tanto, surge la necesidad de identificar métodos profilácticos alternativos para garantizar y contribuir a la sostenibilidad de la salmonicultura chilena. Un novedoso enfoque profiláctico propuesto en esta tesis implica el uso de nanoproteínas recombinantes, también conocidas como cuerpos de inclusión, con funciones antigénicas contra la piscirickettsiosis. Estos cuerpos de inclusión son agregados de proteínas solubles e insolubles con características amiloides, lo que elimina la necesidad de encapsulación. Son escalables, liofilizables y altamente estables en condiciones adversas de temperatura y pH. Esta tesis tiene como objetivo evaluar la capacidad de ciertos cuerpos de inclusión proteicos antigénicos de P. salmonis para inducir una respuesta inmune adaptativa en salmón del Atlántico (Salmo salar) y su uso potencial como inmunógenos en un prototipo de vacuna. Para lograr este objetivo, se diseñaron y produjeron tres secuencias antigénicas con características quiméricas de los genogrupos LF-89 y EM-90 de P. salmonis como cuerpos de inclusión recombinantes en E. coli BL21(DE3). Los prototipos fueron designados para fines de protección comercial como SkipZ, PulseJ y HopQ. Estos prototipos fueron cuantificados y caracterizados mediante técnicas como Western blot. Su captación y actividad inmunoestimulante se evaluaron en macrófagos de salmón mediante ensayos in vitro. Posteriormente, se vacunaron salmones juveniles y se analizaron los efectos de los prototipos SkipZ y HopQ en términos de expresión génica (qPCR) y producción de inmunoglobulinas (ELISA). Los tres prototipos alcanzaron eficiencias de producción de 57 mg/L para PulseJ, 40 mg/L para SkipZ y 26,8 mg/L para HopQ. Estos prototipos fueron internalizados por macrófagos de salmón (RTS-11) con eficiencias de captación del 5% para SkipZ, 26% para PulseJ y 54% para HopQ. Los ensayos in vitro mostraron activación tanto a nivel transcripcional como traduccional de moléculas asociadas con la presentación de antígenos y marcadores proinflamatorios, con notables capacidades de activación observadas para HopQ y SkipZ a 20 µg/mL y 5 µg/mL, respectivamente. Los ensayos in vivo revelaron que ambos prototipos de vacuna, administrados en dosis de 0,5 mg/kg de pescado para SkipZ y 2 mg/kg de pescado para HopQ, activaron de forma robusta la respuesta Th1, con un marcado aumento de la expresión de IFN-γ e IL-12. Esta fuerte regulación positiva podría suprimir la diferenciación de los linfocitos CD8+, lo que podría reducir la eficacia de la respuesta inmunitaria celular para eliminar completamente el patógeno. Sin embargo, este efecto podría contribuir al mantenimiento de la homeostasis en los peces durante la inflamación exacerbada inducida por las vacunas. Además, no se observó ningún cambio significativo en la respuesta Th2, lo que sugiere que la respuesta humoral no se activó predominantemente. En conclusión, los prototipos de vacuna basados ​​en secuencias antigénicas de Piscirickettsia salmonis y producidos como cuerpos de inclusión quiméricos demostraron una potente inmunogenicidad, capaz de inducir una robusta respuesta inmunitaria adaptativa en el salmón del Atlántico. La activación de la respuesta Th1 por HopQ y SkipZ fue particularmente notable. Sin embargo, se necesitan más estudios para evaluar sus efectos protectores en ensayos de desafío con el patógeno, incluidos ambos genogrupos, y para determinar su eficacia a largo plazo.