Thesis:

Diseño, construcción y expresión in vitro de péptidos antimicrobianos recombinantes a partir de cecropina para su aplicación en el control de agentes patógenos en la acuicultura

La modificación de triacilglicéridos (TAG) de aceite de pescado mediante tecnología enzimática ha sido propuesta como una alternativa frente a la hidrólisis química para la concentración de los ácidos eicosapentaenoico (EPA) y docosahexaenoico (DHA), ácidos grasos poliinsaturados Omega-3 asociados a múltiples beneficios para la salud. La hidrólisis de TAG presenta la ventaja de requerir una sola reacción con un único sustrato, a diferencia de la esterificación, en la que se necesitan dadores de acilo, como etilésteres o alcoholes. La selectividad de hidrólisis de ciertas lipasas permite obtener Omega-3 en forma de glicéridos, los cuales son preferibles a los etil-ésteres debido a su mayor biodisponibilidad en el organismo. La inmovilización de lipasas, además de aumentar su estabilidad, modifica su microentorno, lo que permite modular su selectividad frente a un determinado sustrato. En este contexto, el presente estudio tuvo como objetivo establecer un sistema de hidrólisis enzimática de aceite de pescado utilizando lipasas inmovilizadas, con el fin de concentrar EPA + DHA en glicéridos en un valor superior al obtenido con la enzima soluble. Se evaluó el potencial de hidrólisis de aceite de pescado de diferentes lipasas mediante el parámetro propuesto de Índice de Selectividad (IS). La lipasa de Candida cylindracea (CCL) presentó el mayor porcentaje de hidrólisis (69,1%) a las 48 horas de reacción, con un IS de 3,8. A esta lipasa se le aplicaron diferentes soportes y estrategias de inmovilización: adsorción mediante interacciones hidrofóbicas, adsorción combinada con entrecruzamiento con polímeros funcionales, adsorción mediante interacciones iónicas y enlace covalente. Los resultados indicaron que la inmovilización modula negativamente la selectividad de CCL, ya que los valores de IS disminuyeron respecto a la lipasa soluble. Sin embargo, el derivado de CCL inmovilizado en octil-agarosa (O-CCL) presentó el mayor IS (2,7) entre las variantes probadas. Pese a la disminución en selectividad, la estabilidad de la lipasa inmovilizada aumentó considerablemente: el tiempo de vida media de O-CCL fue de 275 horas a 40 °C, mientras que el de la CCL soluble fue de solo 2 horas a la misma temperatura. Además, la presencia de solventes o co-solventes en el medio de reacción (sistema SR III) permitió alcanzar un 90,8% de hidrólisis a las 48 horas, aunque disminuyó la capacidad de reutilización del derivado tras ciclos sucesivos. Finalmente, el sistema SR II, correspondiente al derivado O-CCL en ausencia de solventes/co-solventes, se consideró el más apropiado para la aplicación estudiada. Este sistema de reacción presentó la mayor productividad específica acumulada (144,1 g de aceite hidrolizado/g CCL·h), mejor capacidad de reutilización del soporte y ventajas económicas: a partir del segundo ciclo, utilizando el soporte reciclado, los costos del aceite hidrolizado no solo se igualaron a los del sistema con lipasa soluble (SR I), sino que resultaron inferiores.

The modification of fish oil triacylglycerols (TAG) through enzymatic technology has been proposed as an alternative to chemical hydrolysis for the concentration of eicosapentaenoic acid (EPA) and docosahexaenoic acid (DHA), Omega-3 polyunsaturated fatty acids associated with multiple health benefits. TAG hydrolysis offers the advantage of requiring a single reaction with one substrate, unlike esterification reactions, which need acyl donors such as ethyl esters or alcohols. The hydrolytic selectivity of certain lipases allows obtaining Omega-3 in the form of glycerides, which are preferred over ethyl esters due to their higher bioavailability in the human body. Lipase immobilization not only increases enzyme stability but also modifies its microenvironment, allowing modulation of selectivity toward a specific substrate. Based on this, the aim of the present study was to establish an enzymatic hydrolysis system for fish oil using immobilized lipases to achieve a higher concentration of EPA + DHA in glycerides compared to the soluble enzyme. The hydrolytic potential of different lipases acting on fish oil was evaluated using the proposed Selectivity Index (SI) parameter. Candida cylindracea lipase (CCL) showed the highest hydrolysis percentage (69.1%) after 48 hours of reaction, with an SI of 3.8. Various supports and immobilization strategies were applied to CCL: adsorption through hydrophobic interactions, adsorption combined with crosslinking using functional polymers, adsorption through ionic interactions, and covalent bonding. Results indicated that immobilization negatively modulated CCL selectivity, as SI values decreased compared with the soluble enzyme. However, the derivative immobilized on octyl-agarose (O-CCL) exhibited the highest SI (2.7) among the immobilized variants. Despite the lower selectivity, the immobilized enzyme showed a remarkable increase in stability: the half-life of O-CCL was 275 hours at 40 °C, whereas soluble CCL had a half-life of only 2 hours at the same temperature. In addition, the presence of solvents/co-solvents in the reaction medium (system SR III) enabled a 90.8% hydrolysis yield after 48 hours, though it reduced the reusability of the biocatalyst across successive batches. Finally, the SR II system, corresponding to the O-CCL derivative in the absence of solvents/co-solvents, was identified as the most suitable for the studied application. This reaction system achieved the highest cumulative specific productivity (144.1 g hydrolyzed oil/g CCL·h), superior support reusability, and better economic performance: from the second cycle onward, using the recycled support, the cost of hydrolyzed oil not only equaled but also became lower than that of the system employing soluble lipase (SR I).