Thesis:

Cinética de catálisis enzimática de un sustrato insoluble: hueso de salmón bajo micro-molienda

El salmón es uno de los principales peces de acuicultura en Chile. Para contribuir en el desarrollo sostenible de esta industria se deben incorporar alternativas que generen un beneficio medioambiental, social y económico. Los esquelones son un importante subproducto del proceso de fileteado, ya que representan alrededor del 10% en peso del pescado. Estos están compuestos principalmente por músculo y hueso. La fracción ósea del esquelón, además de colágeno, posee un alto contenido de calcio, mineral deficitario en la dieta contemporánea. El hueso puede ser transformado en un ingrediente funcional mediante la aplicación secuencial de micro-molienda (d_50=10[μm]) e hidrólisis enzimática (Alcalase 2.5L), favoreciendo así la solubilización de Ca^(+2) y la formación de péptidos. Los modelos que generalmente son utilizados para describir la cinética de catálisis son Michaelis-Menten (MM) y Reversa de Michaelis-Menten (RMM), válidos para los casos en que E_0<< S_0+K_m (1) y S_0<<E_0+K_m (2), respectivamente. Dado que para sustratos sólidos la concentración molar S_0 o de sitios accesibles en superficie (sitios de ataque) suele ser desconocida, no es trivial decidir cuál de estas condiciones es la indicada, y por consiguiente cuál debería ser el modelo a utilizar. Otro modelo que ha sido propuesto es el de conservación de sustrato (CS) que sería válido para ambas condiciones, (1) y (2). Independiente del modelo que se utilice, todos ellos implican una rápida formación del complejo ES, seguido de un prolongado período en que d(ES))⁄dt≈0, conocida esta como la condición de Quasi Steady State (QSS). La utilización y validación experimental de estos modelos requieren entonces de dos elementos fundamentales: Para aplicar cualquiera de estos modelos es necesario garantizar que la velocidad inicial de reacción sea medida cuando se haya alcanzado QSS. Esto en catálisis de sistemas homogéneos es prácticamente instantáneo (t=0), pero no necesariamente cierto cuando el sustrato es un sólido con una geometría y estructura compleja. Como el sustrato sólido es normalmente aplicado en términos de concentración másica [g L^(-1)], es necesario introducir un parámetro que estime la relación entre la concentración molar disponible de los sitios de ataque y la carga másica del sustrato, Γ[mol_sustrato g_sustrato^(-1)], requiriéndose entonces la estimación de tres parámetros cinéticos: k_2 (constante de velocidad catalítica, tasa máxima de conversión del complejo ES a producto, por enzima), K_m (constante de Michaelis, indicador de afinidad enzima–sustrato), Γ (parámetro de accesibilidad, moles de sitios de ataque por unidad de masa de sustrato). El objetivo del presente estudio fue evaluar el comportamiento de la cinética en fase heterogénea en medio acuoso de micropartículas de hueso obtenido a partir de esquelón de salmón, estudiando la validez del modelo CS, por medio de la caracterización y el análisis experimental. Se midió formación de producto en el tiempo mediante valoración por pH-Stato. Se obtuvo que el valor de los parámetros cinéticos es de Γ=9.7x10^(-2)±5.5x10^(-3) [μmol g^(-1) ],K_m=4.50±1.59 [μM] , mediante ajustes de regresión no lineal al modelo CS, y k_2=8.49±0.49[s^(-1) ] obtenido a partir de la medición de enzima libre en la fase soluble de la reacción a tQSS. Se resuelve que la proteína de hueso de salmón es un sustrato conservante, y que el modelo CS describe la cinética en fase heterogénea de este sustrato mediante la acción proteolítica de Subtilisina (Alcalase 2.5L).

Salmon is one of the main farmed fish in Chile. To contribute to the sustainable development of this industry, alternatives that generate environmental, social, and economic benefits must be incorporated. Skeletons are an important byproduct of the filleting process, representing approximately 10% of the fish's weight. They are composed primarily of muscle and bone. The bone fraction of the skeleton, in addition to collagen, has a high calcium content, a mineral deficient in the modern diet. Bone can be transformed into a functional ingredient through the sequential application of micro-milling (d_50=10 μm) and enzymatic hydrolysis (Alcalase 2.5L), thus promoting the solubilization of Ca²⁺ and the formation of peptides. The models generally used to describe catalysis kinetics are Michaelis-Menten (MM) and Reverse Michaelis-Menten (RMM), valid for the cases where E_0 << S_0 + K_m (1) and S_0 << E_0 + K_m (2), respectively. Since the molar concentration S_0 or the concentration of accessible surface sites (attack sites) for solid substrates is often unknown, deciding which of these conditions is appropriate, and consequently which model should be used, is not trivial. Another proposed model is the substrate conservation (SC) model, which would be valid for both conditions (1) and (2). Regardless of the model used, all of them involve rapid formation of the ES complex, followed by a prolonged period where d(ES)/dt ≈ 0, known as the Quasi Steady State (QSS) condition. The use and experimental validation of these models therefore require two fundamental elements: To apply any of these models, it is necessary to ensure that the initial reaction rate is measured when QSS has been reached. In the catalysis of homogeneous systems, this is practically instantaneous (t=0), but not necessarily true when the substrate is a solid with a complex geometry and structure. Since the solid substrate is normally applied in terms of mass concentration [g L^(-1)], it is necessary to introduce a parameter that estimates the relationship between the available molar concentration of the attack sites and the mass loading of the substrate, Γ[mol_substrate g_substrate^(-1)]. This requires the estimation of three kinetic parameters: k_2 (catalytic rate constant, maximum rate of conversion of the ES complex to product, per enzyme), K_m (Michaelis constant, indicator of enzyme-substrate affinity), and Γ (accessibility parameter, moles of attack sites per unit mass of substrate). The objective of this study was to evaluate the heterogeneous phase kinetics of bone microparticles obtained from salmon skeletons in an aqueous medium, studying the validity of the CS model through characterization and experimental analysis. Product formation was measured over time using pH-Stato titration. The kinetic parameters were found to be Γ = 9.7 x 10⁻² ± 5.5 x 10⁻³ [μmol g⁻¹] and K_m = 4.50 ± 1.59 [μM] using nonlinear regression fitting to the CS model, and k_2 = 8.49 ± 0.49 [s⁻¹] obtained from measuring free enzyme in the soluble phase of the reaction at tQSS. It is resolved that salmon bone protein is a preservative substrate, and that the CS model describes the heterogeneous phase kinetics of this substrate through the proteolytic action of Subtilisin (Alcalase 2.5L).