Thesis:

Producción de proteínas recombinantes complejas en Pichia pastoris: presencia del pro-domino y su influencia sobre el estrés de retículo

La levadura Pichia pastoris se ha consolidado como una plataforma de expresión económica y eficiente para la producción de proteínas recombinantes, con ventajas como tiempos de expresión rápidos y la capacidad de realizar modificaciones postraduccionales (PTM). Reconocida como GRAS por la FDA, esta plataforma se ha empleado con éxito en la producción de más de 70 proteínas biofarmacéuticas. Sin embargo, su eficacia es limitada en el caso de proteínas recombinantes consideradas “difíciles de expresar”. Este tipo de proteínas son estructuralmente complejas y requieren PTMs específicas, como la formación de enlaces disulfuro y la glicosilación, que son fundamentales para su correcto plegamiento. La sobreexpresión de estas proteínas puede sobrecargar la maquinaria celular de plegamiento y secreción, lo que induce una respuesta de estrés en el retículo endoplásmico (RE). El principal obstáculo para la secreción de una proteína recombinante es su plegamiento incorrecto, que activa la respuesta de proteína no plegada (UPR) y la degradación asociada a RE (ERAD). Una estrategia clave para superar esta limitación es la selección de señales de secreción adecuadas que dirijan de forma óptima el procesamiento postraduccional. Aquí, evaluamos si la presencia del pro-dominio de proteínas “difíciles de expresar” influye en la expresión y secreción de proteínas recombinantes producidas en Pichia pastoris. Para ello, se utilizaron dos proteínas modelo de estructura compleja: la Proteína Morfogenética Ósea 2 (BMP2) y el activador tisular del plasminógeno (tPA). Se diseñaron y generaron cepas transformantes de Pichia pastoris; los constructos genéticos incluían tres variantes para cada proteína: la región madura ("m"), con el pro-dominio completo (pro-) y con una modificación en el sitio de corte Kex2 (K). Las cepas se caracterizaron y, una vez establecidas, se indujo la expresión de las proteínas. Para evitar los efectos del estrés masivo, se utilizaron cepas con una inserción del gen (monocopia). Se evaluó la activación del estrés de retículo mediante la cuantificación de la expresión de marcadores moleculares de UPR y ERAD en los distintos constructos. Los resultados demostraron que(...).

Pichia pastoris yeast has established itself as an economical and efficient platform for producing recombinant proteins, with advantages like rapid expression times and the ability to perform post-translational modifications (PTMs). Recognized as GRAS by the FDA, this platform has been successfully used to produce over 70 biopharmaceutical proteins. However, its effectiveness is limited for so-called "difficult-to-express" recombinant proteins. These proteins are structurally complex and require specific PTMs, such as disulfide bond formation and glycosylation, which are fundamental for their correct folding. Overexpression of these complex proteins can overwhelm the cell's folding and secretion machinery, inducing a stress response in the endoplasmic reticulum (ER). The main obstacle to recombinant protein secretion is incorrect folding, which activates the unfolded protein response (UPR) and ER-associated degradation (ERAD) pathway. A key strategy to overcome this limitation is to select appropriate secretion signals that optimally guide post-translational processing. In this thesis, we evaluated whether the presence of a pro-domain in "difficult-to-express" proteins influences the expression and secretion of recombinant proteins produced in Pichia pastoris. To do this, we designed and generated Pichia pastoris transformant strains carrying genetic constructs for two complex model proteins: Bone Morphogenetic Protein 2 (BMP2) and tissue plasminogen activator (tPA). The constructs included three variants for each protein: the mature region ("m"), the full pro-domain ("pro-"), and a modification in the Kex2 cleavage site ("K"). The strains were characterized and, once established, protein expression was induced. To avoid the effects of massive stress, we used strains with a single gene insertion (monocopy). We evaluated the activation of ER stress by quantifying the expression of molecular markers for UPR and ERAD in the different constructs. The results showed that(...).