Thesis:

Producción y caracterización de alcohol deshidrogenasas dependientes de NAD para la oxidación de alcoholes alifáticos superiores

El proceso Kraft para la producción de pulpa de celulosa genera residuos con alto potencial de revalorización. Una de las fracciones obtenidas del residuo conocido como jabón de licor negro corresponde a la fracción neutra liviana, compuesta principalmente por policosanoles, entre ellos los alcoholes alifáticos primarios de 22 y 24 carbonos: docosanol y tetracosanol. La obtención de ácidos grasos de cadena larga mediante la oxidación de estos policosanoles tiene un valor relevante para las industrias farmacéutica, alimentaria y cosmética. El objetivo central de esta tesis fue seleccionar microorganismos productores de alcohol deshidrogenasas e inducir en ellos la síntesis de una enzima capaz de oxidar alcoholes de 22 y 24 átomos de carbono mediante la adición de alcanos o alcoholes al cultivo. Se evaluaron siete cepas: una mesófila (Candida tropicalis ATCC 20336), una termófila (Thermus A131) y cinco termófilas extremas (Thermus thermophilus H1327, HN111, NR17, PRQ16 y PRQ25). Solo Candida tropicalis ATCC 20336, Thermus A131 y T. thermophilus PRQ25 lograron producir, mediante la inducción con hexacosanol, docosanol y eicosanol respectivamente, alcohol deshidrogenasas capaces de oxidar alcoholes de 14, 22 y 24 carbonos. La actividad máxima sobre tetracosanol, docosanol y tetracosanol se obtuvo con la enzima de C. tropicalis ATCC 20336, con valores de 86,7; 196,9 y 218,8 pmol/min/g de proteína, respectivamente. Los mayores niveles enzimáticos se registraron cuando el inductor se añadió al inicio de la fermentación y las células se recolectaron al comienzo de la fase estacionaria (entre 100 y 140 h). La purificación de las alcohol deshidrogenasas provenientes de C. tropicalis ATCC 20336, Thermus A131 y T. thermophilus PRQ25 se logró mediante una mezcla de matrices cromatográficas catiónicas y aniónicas, obteniéndose factores de purificación de 39, 237 y 567, y rendimientos de actividad de 24% y 36% para las enzimas de C. tropicalis y Thermus, respectivamente. Los mejores biocatalizadores se obtuvieron tras inmovilizar las enzimas en glioxil agarosa BCL mediante unión covalente multipuntual, alcanzando actividades de 1,84; 1,82 y 2,09 μmol/min·g de soporte para C. tropicalis ATCC 20336, Thermus A131 y T. thermophilus PRQ25, respectivamente, evaluadas sobre tetracosanol. La máxima actividad se registró a pH 7,0 y 50 °C para C. tropicalis, 60 °C para Thermus A131 y 70 °C para T. thermophilus PRQ25, en presencia de 2 mM de FeSO₄. Los estudios de conversión mostraron que la alcohol deshidrogenasa de C. tropicalis ATCC 20336 inmovilizada es el mejor biocatalizador para la oxidación de tetradecanol, alcanzando 84% de conversión tras 72 h, con un rendimiento de 67% de ácido tetradecanoico y 17% de tetradecanal. En cambio, la enzima de T. thermophilus PRQ25 resultó más eficiente para la oxidación de docosanol y tetracosanol, con conversiones de 85,9% y 78,7% y rendimientos de 61,7% para ácido docosanoico y 35,8% para ácido tetracosanoico, respectivamente.

The Kraft process for cellulose pulp production generates residues with high potential for valorization. From the residue known as black liquor soap, the light neutral fraction is obtained, which is mainly composed of policosanols, including the aliphatic alcohols with 22 and 24 carbons: docosanol and tetracosanol. The production of long-chain fatty acids through the oxidation of these policosanols has relevant applications in the pharmaceutical, food, and cosmetic industries. The main objective of this thesis is to select microorganisms capable of producing alcohol dehydrogenases and to induce in them the production of enzymes able to oxidize 22- and 24-carbon alcohols by adding alkanes or alcohols to the cultures. Seven strains were evaluated: one mesophilic strain (Candida tropicalis ATCC 20336), one thermophilic strain (Thermus A131), and five extreme thermophiles (Thermus thermophilus H1327, HN111, NR17, PRQ16, and PRQ25). Only Candida tropicalis ATCC 20336, Thermus A131, and Thermus thermophilus PRQ25 were able to produce alcohol dehydrogenases capable of oxidizing 14-, 22-, and 24-carbon alcohols when induced with hexacosanol, docosanol, and eicosanol, respectively. The enzyme from Candida tropicalis ATCC 20336 showed the highest oxidation activities toward tetracosanol, docosanol, and tetracosanol (86.7, 196.9, and 218.8 pmol·min⁻¹·g⁻¹ protein). The highest enzyme levels were obtained when the inducer was added at the beginning of fermentation and cells were harvested at the onset of the stationary phase (100–140 h).The enzymes from Candida tropicalis ATCC 20336, Thermus A131, and Thermus thermophilus PRQ25 were purified using cation- and anion-exchange chromatography, achieving purification factors of 39, 237, and 567, and activity yields of 24% and 36%, respectively. The best biocatalysts were obtained by immobilizing the enzymes on glyoxyl-agarose through multipoint covalent attachment, reaching activities of 1.84, 1.82, and 2.09 µmol·min⁻¹·g⁻¹ of support, evaluated using tetracosanol as the substrate. Maximum activities were recorded at pH 7.0 and 50°C for Candida tropicalis ATCC 20336, 60°C for Thermus A131, and 70°C for Thermus thermophilus PRQ25, in the presence of 2 mM FeSO₄. The conversion assays revealed that the immobilized alcohol dehydrogenase from Candida tropicalis ATCC 20336 is the most efficient biocatalyst for tetradecanol oxidation (84% conversion after 72 h, with a 67% yield of tetradecanoic acid). In contrast, the enzyme from Thermus thermophilus PRQ25 showed better performance for the oxidation of docosanol and tetracosanol, reaching conversions of 85.9% and 78.7% and yields of 61.7% and 35.8% of docosanoic acid and tetracosanoic acid, respectively.