Thesis:

Descripción, caracterización y proyección biotecnológica de genes relacionados con la virulencia en el patógeno Piscirickettsia salmonis

Piscirickettsia salmonis es una bacteria Gram negativa, agente etiológico de la Septicemia Rickettsial Salmonídea (SRS) o Piscirickettsiosis, enfermedad que desde hace más de dos décadas amenaza la sustentabilidad de la salmonicultura en Chile. A pesar del gran impacto económico que produce esta enfermedad, aspectos básicos de la biología del patógeno siguen siendo desconocidos. En los últimos años, su clasificación taxonómica ha cambiado significativamente: inicialmente se la consideró una Alfa-proteobacteria relacionada con Rickettsia, pero actualmente se la clasifica dentro de las Gamma-proteobacteria, cercana a Legionella pneumophila, Francisella tularensis y Coxiella burnetii. Asimismo, fue descrita como un organismo intracelular obligado, aunque hoy se reconoce como intracelular facultativo. Si bien actualmente es posible obtener cultivos puros de P. salmonis, la secuenciación completa de su genoma aún no ha sido reportada, por lo que los genes involucrados en metabolismo celular y virulencia permanecen poco caracterizados. Esta falta de información ha dificultado el desarrollo de medidas profilácticas y terapéuticas eficaces. En otros patógenos, el conocimiento de los mecanismos de virulencia ha permitido diseñar vacunas o fármacos efectivos para el control de enfermedades. Considerando que la virulencia bacteriana suele estar asociada a la secreción de moléculas efectoras mediante sistemas especializados, esta tesis estudió los mecanismos de patogenicidad y virulencia de P. salmonis, con el propósito de aportar información clave para el desarrollo de nuevas estrategias de control. El objetivo principal fue identificar genes relacionados con alguno de los seis sistemas de secreción conocidos en bacterias Gram negativas, para determinar su posible participación en la patogenicidad. Se emplearon dos estrategias: i) diseño de cebadores degenerados basados en regiones conservadas de proteínas estructurales de cada sistema, y ii) secuenciación parcial del genoma de P. salmonis. Los resultados revelaron la presencia de los sistemas de secreción tipo I (SSTI) y tipo IV-B (SSTIV-B o Dot/Icm). En el SSTI se identificaron tres genes (dos estructurales: tolC y hlyD, y uno efector: α-hemolisina), activos en distintas condiciones de cultivo, lo que sugiere un sistema funcional asociado al efecto citotóxico y lítico de la bacteria. En el sistema Dot/Icm se detectaron los genes dotB, dotA, icmK e icmE, con alta similitud a los de L. pneumophila y C. burnetii, patógenos en los que este sistema facilita la supervivencia intracelular y evasión inmunológica. Los genes se expresaron tanto durante la infección in vitro como en medio libre de células, con aumento de expresión en condiciones de pH ácido, lo que indica una regulación ambiental similar a la observada en otros patógenos. La secuenciación parcial del genoma reveló además otros posibles mecanismos de virulencia: el pili tipo IV, asociado a adhesión y formación de biofilm, y la biosíntesis flagelar, cuyos genes reguladores se encontraron activos pese a la aparente inmovilidad de la bacteria. En conjunto, los resultados de esta tesis aportan nuevo conocimiento sobre los factores de virulencia de P. salmonis, demostrando que posee un repertorio génico que favorece su supervivencia frente a las defensas del huésped. Estos genes representan potenciales blancos para el desarrollo de vacunas o fármacos destinados al control de la Piscirickettsiosis.

Piscirickettsia salmonis is a Gram-negative bacterium and the etiological agent of Salmonid Rickettsial Septicemia (SRS) or Piscirickettsiosis, a disease that has threatened the sustainability of the Chilean salmon farming industry for more than two decades. Despite the major economic impact of this disease, key aspects of the pathogen’s biology remain unknown. In recent years, its taxonomic classification has changed significantly: initially considered an Alpha-proteobacterium related to Rickettsia, it is now classified as a Gamma-proteobacterium, closely related to Legionella pneumophila, Francisella tularensis, and Coxiella burnetii. Likewise, it was originally described as an obligate intracellular organism, although it is now recognized as a facultative intracellular bacterium. Although pure cultures of P. salmonis can now be obtained, the complete genome sequence has not yet been reported, leaving the genes involved in cellular metabolism and virulence poorly characterized. This lack of information has hindered the development of effective prophylactic and therapeutic measures. In other pathogens, understanding virulence mechanisms has made it possible to design effective vaccines or drugs for disease control. Considering that bacterial virulence is often associated with the secretion of effector molecules through specialized systems, this thesis studied the pathogenicity and virulence mechanisms of P. salmonis to provide key information for developing new control strategies. The main objective was to identify genes related to any of the six known secretion systems in Gram-negative bacteria to determine their possible role in pathogenicity. Two strategies were employed: (i) the design of degenerate primers based on conserved regions of structural proteins from each system, and (ii) partial genome sequencing of P. salmonis. The results revealed the presence of Type I (T1SS) and Type IV-B (T4BSS or Dot/Icm) secretion systems. In the T1SS, three genes were identified —two structural (tolC and hlyD) and one effector (α-hemolysin)— active under different culture conditions, suggesting a functional system associated with the cytotoxic and lytic effects of the bacterium. In the Dot/Icm system, the genes dotB, dotA, icmK, and icmE were detected, showing high similarity to those in L. pneumophila and C. burnetii, pathogens in which this system facilitates intracellular survival and immune evasion. These genes were expressed both during in vitro infection and in cell-free medium, with increased expression under acidic pH, indicating environmental regulation similar to that observed in other pathogens. Partial genome sequencing also revealed other possible virulence mechanisms: the Type IV pili, associated with adhesion and biofilm formation, and flagellar biosynthesis, whose regulatory genes were active despite the apparent non-motility of the bacterium. Overall, the results of this thesis provide new insights into the virulence factors of P. salmonis, demonstrating that it possesses a genetic repertoire that promotes its survival against host defenses. These genes represent potential targets for developing vaccines or drugs aimed at controlling Piscirickettsiosis.